Cours de chromatographie de www.chimie-sup.fr

 

 

chapitre I        Notions fondamentales 3

I.1        Paramètres fondamentaux_ 3

I.2        Efficacité des colonnes 3

I.3        Analyse quantitative_ 4

chapitre II      CPG_ 5

II.1      Cinétique de séparation_ 5

II.2      Appareillage_ 5

II.2.1      Les colonnes remplies 5

II.2.2      Les colonnes capillaires 5

II.2.3      Les colonnes semi-capillaires 6

II.3      Détecteurs 6

II.3.1      Caractéristiques d’un détecteur 6

II.3.2      Définition_ 6

II.3.3      Catharomètre 7

II.3.4      Détecteur à ionisation de flamme (FID) 7

II.3.5      Détecteur à capture d’électrons 7

II.3.6      Détecteur à photométrie de flamme (FPD) 8

II.3.7      Détecteur thermoionique (NPD) 8

II.3.8      Détecteur à photoionisation_ 8

II.4      Classification des phases stationnaire_ 8

II.4.1      Indice de Kovats et droite de Kovats 8

II.4.2      Constantes de phases stationnaires 9

II.5      Optimisation de séparation_ 9

chapitre III     Chromatographie en phase liquide 10

III.1     Comparaison chromatographie phase liquide et phase gaz 10

III.2     Loi de Darcy 10

III.3     Solvants utilisés en HPLC_ 10

III.3.1         Interactions moléculaires entre phase mobile et solutés 11

III.3.2         Force éluante et polarité 11

III.3.3         Polarité selon Snyder 11

III.4     Appareillage_ 12

III.4.1         Dispersion hors colonne 12

III.4.2         Réservoirs de solvants 12

III.4.3         Dispositif de pompage 13

III.4.4         Dispositif d’injection_ 13

III.4.5         Colonnes 13

III.5     Détecteurs 13

III.5.1         Photomètre UV-visible 13

III.5.2         Réfractomètre 14

III.5.3         Détecteur fluorimétrique 14

III.5.4         Détecteur électrochimique 14

III.5.5         Conductimètre 14

III.5.6         Diffusion de lumière 14

chapitre IV     Chromatographie de partage 15

IV.1     Introduction_ 15

IV.2     Phases normales 15

IV.3     Phases inversées 15

chapitre V       Chromatographie d’adsorption_ 16

V.1       Phase stationnaire_ 16

V.2       Phase mobile_ 16

V.3       Mécanisme de rétention_ 16

V.3.1      En CCM_ 16

V.3.2      Théorie de Snyder 16

chapitre VI     Chromatographie ionique 17

VI.1     Introduction_ 17

VI.2     Chromatographie d’échange d’ions 17

VI.3     Appariement d’ions 17

VI.3.1         Influence de divers paramètres 17

chapitre VII        Electrophorèse capillaire 18

VII.1        Introduction_ 18

VII.2        Définitions 18

VII.2.1        Propriétés des électrolytes 18

VII.2.2        Mobilité électrophoretique µep 18

VII.2.3        Mobilité électroosmotique µeo 18

VII.2.4        Mobilité apparente 18

VII.3        Analyse quantitative_ 19

VII.3.1        Injection_ 19

VII.3.2        Détection_ 19

 

 


I - Notions fondamentales

 

I.1          Paramètres fondamentaux :

 

- Coefficient de distribution KA :                                                                                

 

Temps de rétention tR, volume de rétention VR

Temps de rétention tR’, volume de rétention réduit VR

tR=tR’+t0

t0 : temps mis par la phase mobile pour aller de l’injecteur au détecteur.

 

- Facteur de capacité k’ :                                                                                          

Rqe : k’ ne dépend que de la nature des phases.

 

- Sélectivité α :                                                                                              

Les pics sont séparés si α>1,1.

Rqe : α ne dépend que de la nature des phases stationnaire et mobile.

 

- Résolution Rs :                                                                                                       

Les pics sont résolus si Rs>1,5.

Rqe : Rs dépend des conditions opératoires.

 

Si ω1 = ω2 , ; En effet si ω1 = ω2 alors ω12 = 2ω2 d’où ,

or tR1 = t0(k’1+1) et tR2 = t0(k’2+1) d’où , or  ainsi

de plus  soit

 

 

I.2          Efficacité des colonnes :

 

- Nombre de plateaux N :                                                                                         

 

H : hauteur équivalente à un plateau théorique, 100<N<500000.

Rq : Si on augmente la longueur de la colonne, k’ n’est pas modifiée ; le nombre de plateaux ne dépend pas de la nature des phases.

 

- Nombre de plateaux théoriques :                                                                             

N traduit la finesse des pics, il a un effet sur Rs mais pas sur α.

 

- Dispersion :

Elle est due :

 

Théorie de Van Deemter :

H=A+B/u+C.u, approximation car A et C ne sont pas complètement indépendants.

 

Théorie de Knox :

H=A.u1/3+B/u+C’.u

 

I.3          Analyse quantitative

 

- Etalonnage externe :

Préparation de solutions de titres connus. Tracé de Signal=f(C)

 

- Etalonnage interne :

1. Préparation de solutions étalons A1 de titre x1, A2 de titre x2, A3 de titre x3. 2. Préparation d’une solution d’étalonnage interne (EI). 3. Mélange d’un volume constant de A et d’un volume constant d’EI.

 

V1=VA1+VEI

V2=VA2+VEI

V3=VA3+VEI

Tracé de AA/AEI=f(CA)

Choix de l’étalon interne :

 

- Méthode des ajouts dosés :

On s’affranchit du volume injecté et de l’ajout d’un composé non présent.

On introduit l’échantillon contenant A et B, et on ajoute des quantités connues mA de A dans l’échantillon.

V1=VAB+VA

V2=VAB+2*VA

V3=VAB+3*VA

Tracé de AA/AB=f(mA)

 


II - CPG

 

I.4          Cinétique de séparation

 

Interactions :

Soluté Û Phase Stationnaire

Gaz vecteur : H2, He, N2, Ar, CO2 ; le choix du gaz est conditionné par le détecteur.

 

I.5          Appareillage

 

- L’injecteur amène en tête de colonne l’échantillon sous forme gazeuse avec une dispersion faible, on peut injecter des liquides, des gaz et dans certains cas des solides.

 

- Mode d’injection :

 

I.5.1         Les colonnes remplies

 

La phase stationnaire est un solide et met en jeu un équilibre d’adsorption.

 

o       Noir de carbone, graphite (carbopack B) sépare les composés en fonction de la taille.

o       Tamis moléculaire au carbone (carbox en 1000) analyse les gaz et les hydrocarbures légers (surface spécifique>1200 m2.g-1).

o       Polymères.

o       Terre de diatomées (Chromsorb P).

o       Silice-Alumine-Zéolithes.

V0 : volume de vide, D : diamètre du tube, L : longueur du tube.

 

La porosité totale est égale à la somme de la porosité intergranulaire (entre les grains) et intragranulaire (dans les grains).

 

I.5.2         Les colonnes capillaires

 

Si la phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un solide, elle met en jeu une constante de partage gaz/phase liquide.

 

Si la phase stationnaire est une espèce organique liée chimiquement à une surface solide, elle met en jeu une constante de partage gaz/phase greffée.

 

Exemples de phases stationnaires : hydrocarbures ramifiés (squalane), polydialkylsiloxanes (silicones SE30®, OV17®, CPSIL5®) greffés ou non, polyéthers (Carbowax®) et polyesters (DEGS).

 

Les colonnes sont constituées d’un tube de silice fondue de diamètre externe 0,25 à 2 mm à l’intérieur duquel est déposée une phase stationnaire de diamètre interne 0,05 à 0,35 mm.

Le volume injecté dans PLOT est plus élevé.

 

I.5.3         Les colonnes semi-capillaires

 

 

I.6          Détecteurs

 

I.6.1         Caractéristiques d’un détecteur

 

 

I.6.2         Définition

 

 

 

 

 

 

I.6.3         Catharomètre

 

Détecteur à conductibilité thermique quasi universel comprenant un montage différentiel (pont de Wheastone) dont les résistances compensent le déséquilibre de conductivité par une perte de chaleur.

 

Le gaz vecteur doit avoir une bonne conductibilité thermique tel que H2 ou He et posséder une conductivité différente de celle des solutés.

 

Caractéristiques :

 

I.6.4         Détecteur à ionisation de flamme (FID)

 

Détecteur le plus utilisé et spécifique aux composés carbonés sauf HCHO et HCOOH.

 

Principe :

 

Caractéristiques :

 

I.6.5         Détecteur à capture d’électrons

 

Détecteur spécifique aux dérivés halogénés. L’électron est formé à partir d’un gaz par des particules β- provenant du 63Ni ou du tritium. N2→N2++e-

 

Mécanisme :     M+e-→M-   //     M-+N2+→M+N2

 

On mesure la variation de courant électrique entre I° (en l’absence de molécules) et I (courant résiduel en présence de soluté). I=I°e-kC , détecteur non linéaire.

 

Caractéristiques :

 

I.6.6         Détecteur à photométrie de flamme (FPD)

 

Détecteur spécifique du phosphore et du soufre qui émet respectivement à 526 nm et 394 nm.

On utilise une flamme qui brûle les molécules et excite les atomes émettant un rayonnement.

 

Caractéristiques :

3.10-13 g.s-1 pour P.

 

I.6.7         Détecteur thermoionique (NPD)

 

Détecteur spécifique aux molécules azotées et phosphorées.

 

Caractéristiques :

N/P >102.

 

I.6.8         Détecteur à photoionisation

 

Les composés à analyser sont ionisés par un faisceau UV intense au Xe ou Ar d’énergie respective 8,3 eV et 11,7 eV ; des électrodes collectent les ions formés.

 

Applications :

 

I.7          Classification des phases stationnaire

 

I.7.1         Indice de Kovats et droite de Kovats

 

L’objectif est de caractériser la rétention de différents solutés sur une phase stationnaire.

Pour un alcane linéaire : I = 100n, avec n : le nombre d’atomes de carbones.

 

La droite de Kovats est établie sur une série d’homologues et dans des conditions opératoires fixées en régime isotherme et isobare. Log tR’ = an+b

 

 

Pour un composé X : IX = 100α, avec α le nombre fictif d’atomes de carbones de l’alcane linéaire équivalent où

Il existe des tables de IX afin d’identifier un composé inconnu.

 

I.7.2         Constantes de phases stationnaires

 

 

I.8          Optimisation de séparation

 

Paramètres :

La température de la colonne suit la loi de Van’t Hoff :

 et par suite

On peut aussi appliquer un gradient de température à la colonne.

 

Le débit moyen de gaz est donné par : Dm=0,47 u d

Avec u,  vitesse linéaire moyenne du gaz vecteur en cm.s-1 et d : le diamètre interne de la colonne.

 

Relation entre Dm et Rs :                                                                               

 

 


III - Chromatographie en phase liquide

 

I.9          Comparaison chromatographie phase liquide et phase gaz

 

Interactions :

Soluté Û Phase Stationnaire

Soluté Û Phase Mobile

 

 


Avantage CL/CG

 

 

 

 

 

Inconvénient CL/CG


 

I.10     Loi de Darcy

avec

ΔP : perte de charge dans la colonne

Ф : facteur de remplissage de la colonne

η : viscosité dynamique (Pa.s ou Cp)

η(eau) = 0,89 Cp, η(MeOH) = 0,54 Cp, η(ACN) = 0,34 Cp

u : vitesse linéaire moyenne de la phase mobile

dp : diamètre des particules de la phase stationnaire

 

En HPLC la pression normale est 200 bars ; on peut jouer sur la vitesse u et la viscosité du fluide afin de ne pas dégrader la colonne avec des pressions trop élevées.

 

I.11     Solvants utilisés en HPLC

 

Proportions : Tous les solvants existants > solvants chimiquement compatibles avec l’HPLC > solvants faisant des interactions avec les solutés > solvants qui vont permettre une bonne séparation.

 

Différents paramètres sont à prendre en compte :

I.11.1     Interactions moléculaires entre phase mobile et solutés

 

 

I.11.2     Force éluante et polarité

 

Pour les composés polaires : + la phase mobile sera polaire, + elle va entraîner les solutés.

+ la phase mobile sera apolaire, - elle va entraîner les solutés.

 

Pour les composés peu polaires : + la phase mobile sera polaire, - elle va entraîner les solutés et inversement

 

I.11.3     Polarité selon Snyder

 

On mesure le coefficient de distribution entre le solvant étudié et différentes phases stationnaires

 

Ex : éthanol : donneur de protons, dioxane : accepteur de protons, nitrométhane : moment dipolaire élevé.

 

La polarité globale d’un mélange de trois solvants sera : P’ = logK1+logK2+logK3

En normant : x1+x2+x3 = 1

Alors x1 = logK1/P’

 

Paramètres de solubilités d’Hidelbrand

 

avec Es : l’énergie moléculaire de cohésion et Vs : le volume molaire de solvant

 

Paramètres de solubilités partielles :

δd : interactions de dispersion du nuage électronique, interactions diélectriques

δo : interactions d’orientation, dipôles permanents

δi : interactions dipôles induits

δa, δb : interactions acide/base, par transfert de liaisons H

 

δtot2 = δd2o2+2δoδiaδb

 

Phase mobile/soluté

Non polaire/non polaire

Polaire/non polaire

Polaire/polaire

Dispersion

+

+

+

Orientation

-

-

+

Induction

-

-

+

Acide/base

-

-

+

 


I.12     Appareillage

 

 

I.12.1     Dispersion hors colonne

 

Cause un élargissement des pics autre que dans la colonne

L’efficacité observée est : l’efficacité de la colonne et la dispersion des solutés hors de la colonne (les tubes de liaisons, volume injecteur, détecteur)

 

La dispersion due aux tubulures :

On définit L : longueur utilisable pour ne pas augmenter la largeur des pics de 5%

 

avec :

Dm : diffusivité du soluté (cm2.g-1)

D : débit d’éluant (mL.s-1)

d : diamètre du tube (cm)

N : nombre de plateaux théoriques

Vr : volume de rétention (mL)

 

Estimation de la dispersion hors colonne : on enlève la colonne et on injecte les solutés, on obtient ainsi ω(hors colonne) = 4σ(hors colonne)

 

σtot2 = σcolonne2+ σhors colonne2

 

I.12.2     Réservoirs de solvants

 

Flacons en verre, on utilise une crépine pour éliminer les poussières et les bulles.

1. filtration des solvants

2. dégazages aux ultrasons

 

I.12.3     Dispositif de pompage

 

Débits utilisés : 0,1-2 mL.min-1

Utilisation de pompes alternative : faible volume interne et utilisable avec des gradients d’élution

 

I.12.4     Dispositif d’injection

 

On dépose l’échantillon en tête de colonne.

ΔP en HPLC est de l’ordre de qqs dizaines à 100-250 bars.

 

Vanne d’injection :

6 voies pour les solvants

2 positions load et inject

 

I.12.5     Colonnes

Tubes en inox de longueur L = 10 à 25 cm

dtube = 4,6 mm le plus courant

dp = 3 à 10 µm

N = 40000 à 60000 plateaux/m

 

On utilise aussi des micros colonnes

Avec L = 3 à 7,5 cm

Dp = 3 à 5 µm

On limite ainsi la consommation de solvants.

 

On place souvent des pré-colonnes qui font office de filtres ; elles ont un dp supérieur et protègent la colonne des impuretés.

 

I.13     Détecteurs

 

I.13.1     Photomètre UV-visible

 

Il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. E opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deuterium est utilisé pour des longueurs d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe à vapeur de mercure est utilisé à la longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :

 

Les transitions possibles sont :


-        π→π* : systèmes conjugués

-        σ→σ* : non visible en UV

-        n→π* : carbonyles

-        n→σ* : alcools


Choix de la longueur d’onde λ de mesure en fonction du soluté et de la phase mobile qui doit peu absorber à cette longueur d’onde.

 

Loi de Beer-Lambert : Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de concentration C et de trajet optique égal à l. Si I0 est l'intensité du rayon lumineux à l'entrée de la solution et I son intensité à la sortie, alors :

A = D.O = log (I0 / I) = e l C

A est l'absorbance, D.O la densité optique, Io l'intensité lumineuse incidente, I l'intensité lumineuse transmise, e le coefficient d'extinction molaire caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée en L mol-1 cm-1, l l'épaisseur traversée en cm et C la concentration en mol.L-1.

 

Plusieurs types de détecteurs :

 

Sur le spectre de soluté :

 

I.13.2     Réfractomètre

 

Il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure : il y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut les variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec ce détecteur.

 

I.13.3     Détecteur fluorimétrique

 

Après excitation de l’échantillon dans la gamme UV, on mesure la fluorescence restituée.

Méthode très sensible, qui permet de détecter 1 seule molécule.

 

I.13.4     Détecteur électrochimique

 

Réactions d’oxydoréductions qui produisent un courant proportionnel à la concentration du soluté. Applications : drogues, polluants, produits naturels.

 

I.13.5     Conductimètre

 

I.13.6     Diffusion de lumière

 

Après nébulisation, évaporation, on envoie un faisceau de lumière - Détecteur universel -

Il faut des différences de diffusivité entre le soluté et la phase mobile.

IV - Chromatographie de partage

 

I.14     Introduction

 

Interactions :             Soluté Û Phase Stationnaire          &         Soluté Û Phase Mobile

La phase stationnaire est soit un liquide immobilisé sur un support par adsorption, soit greffée par liaisons chimiques qui augmente la durée de vie.

 

Chromatographie de partage à polarité de phases normales : Phase stationnaire polaire, Phase mobile peu polaire.

Chromatographie de partage à polarité de phases inversées : Phase stationnaire apolaire, Phase mobile polaire.

 

I.15     Phases normales

 

On utilise des ph. stationnaires polaires : phases greffées (aminopropyl +polaire que cyanopropyl) et des phases mobiles apolaires pour séparer des composés polaires et moyennement polaires.

Le pouvoir éluant d’une phase mobile est la somme des polarités de chacun des solvants.

 

I.16     Phases inversées

 

On utilise des phases stationnaires apolaires : phases C8 ou C18 et des phases mobiles polaires (eau) pour séparer des composés peu polaires (hydrophobes) et moyennement polaires.

 

La phase mobile est constituée d’un fort pourcentage d’eau.

Attention à la miscibilité de tous les solvants ex : MeOH, ACN, THF, CH2Cl2.

 

Coefficient de partage octanol/eau :

Poe = Kow =

Log Kow = Σfi+cste

Avec, fi les cstes de Rekker, Log k’ = a log Poe + b, k’ facteur de capacité et a et b cste dépendant de la phase mobile.

Zone de Texte: Fragment	fi
C6H6	1,886
CH2	0,530
COOH	-0,954
CO	-1,703
CH3	0,702
CH	0,235
C	0,150
N	-2,16

Phases isoéluantes : phases qui conduisent à des k’ voisins mais les interactions mises en jeu peuvent être différentes.

 

2 phases isoéluantes pour un couple de solutés ne le seront pas pour un autre couple.

 

 

loi générale : log k’ = Aφ12+B φ2+C

avec φ1 composition du solvant 1 dans la phase mobile

 


Pour un mélange binaire : log k’ = log k’0 – mc

k’0 : facteur de capacité avec pour ph. mobile (eau)

m : force de solvant

c : % de solvant

 

Pour un mélange ternaire (eau, solv1, solv2) :

A1φ12+A2φ2+B1Aφ12+B1φ1+B2φ2+C+Dφ1φ2

 

Pour une famille d’homologues : log k’ = An+B


 

V - Chromatographie d’adsorption

 

I.17     Phase stationnaire

 

Silice : adsorbant très polaire

La capacité d’adsorption et la polarité varient en fonction du taux d’hydratation.

 

I.18     Phase mobile

 

Mélange de solvant

Avec ε0 force éluante

            Si ε0 = 0, pas d’adsorption de phase mobile sur phase stationnaire

            Si ε0 augmente alors le pouvoir éluant augmente aussi et les molécules de phase mobile prennent la place des molécules de soluté.

 

I.19     Mécanisme de rétention

 

I.19.1     En CCM

 

La phase stationnaire est immobilisée et la migration se fait par capillarité.

La vitesse de migration du solvant est  et celle du soluté  où tM est le temps de migration.

D’où  

Sur la colonne  et  d’où

Les vitesses étant égales en CCM et en HPLC :                                 

 

I.19.2     Théorie de Snyder

 

Loi de rétention :

Loi de Snyder :

β* étant le taux d’activité de la silice : si = 1 silice déshydratée, si = 0 silice désactivée.

 

Le domaine d’application se situe dans la séparation d’isomères.

 


VI - Chromatographie ionique

 

I.20     Introduction

 

Elle sépare les solutés ioniques (sels) ou ionisables (molécules organiques) et tend à être remplacée par l’électrophorèse capillaire.

3 types :

 

I.21     Chromatographie d’échange d’ions

 

La phase stationnaire est ionique :

Une phase stationnaire anionique permet de séparer des cations

 

La phase mobile est un électrolyte, la rétention dépend du pH, de la force ionique

Si I augmente, k’ diminue, il y a rétention de la phase mobile sur la phase stationnaire.

 

Détection : Conductimétrie : on mesure la conductance de la solution et on place des suppresseurs d’ions pour augmenter la sensibilité.

 

I.22     Appariement d’ions

 

On ajoute dans la phase mobile un agent d‘appariement d’ions (AAI) = un tensioactif.

La phase stationnaire est similaire à la chromatographie de partage en phase inversée.

 

I.22.1     Influence de divers paramètres

 


 

VII - Electrophorèse capillaire

 

I.23     Introduction

 

Méthode qui permet la séparation d’espèces en milieu biologique (protéines) difficilement séparée par l’HPLC.

 

L’électrophorèse de zone : migration des espèces chargées dans un champ électrique, et en solution dans l’électrolyte.

 

I.24     Définitions

 

I.24.1     Propriétés des électrolytes

 

Ions, molécules ou particules chargées soumises à un champ électrique subissent une force :

Force de friction :

D’où la vitesse de la particule

 

I.24.2     Mobilité électrophoretique µep

 

Mobilité de l’espèce chargée dans un électrolyte supposé immobile :

Et

 

I.24.3     Mobilité électroosmotique µeo

 

Mobilité de l’électrolyte

Une espèce neutre se déplace à la vitesse

 

I.24.4     Mobilité apparente

 

Soit la tension appliquée V dans un champ E, avec L, la longueur du capillaire :

Soit le temps de migration, avec l, la longueur de migration :

 

Alors

 


I.25     Analyse quantitative

 

I.25.1     Injection

 

Soit qi la quantité de produit détectée ; alors quelque soit le mode de détection : , avec Ai la concentration de produit i dans l’électrolyte et tMi son temps de migration.

 

En injection hydrodynamique : la composition de l’échantillon n’est pas modifiée.

Alors

 

En injection électrocinétique : l’injection se fait via un champ électrique donc les compositions de l’échantillon injecté et de l’échantillon dans l’électrolyte sont différentes.

Alors

 

I.25.2     Détection

 

En E.C. les solutés traversent la cellule de détection à leur vitesse propre, ce qui fait qu’on détecte une quantité q de produit dans un volume V de concentration C pendant dt.

Avec un détecteur linéaire la réponse est proportionnelle à la concentration.

 

Quantité de produit détecté q :

S : section du capillaire

v : vitesse du produit dans le capillaire

V : volume de produit de concentration C

K : cte

 



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