Cours de chromatographie et d'électrophorèse (CPG, HPLC, CI, CE)

Chromatographie et éléctrophorèse

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Cours© de Nicolas Probst , ingénieur escom,

Tables des matières

chapitre I Notions fondamentales 3

I.1 Paramètres fondamentaux _ 3

I.2 Efficacité des colonnes 3

I.3 Analyse quantitative _ 4

chapitre II CPG _ 5

II.1 Cinétique de séparation _ 5

II.2 Appareillage _ 5

II.2.1 Les colonnes remplies 5

II.2.2 Les colonnes capillaires 5

II.2.3 Les colonnes semi-capillaires 6

II.3 Détecteurs 6

II.3.1 Caractéristiques d’un détecteur 6

II.3.2 Définition _ 6

II.3.3 Catharomètre 7

II.3.4 Détecteur à ionisation de flamme

(FID) 7

II.3.5 Détecteur à capture d’électrons 7

II.3.6 Détecteur à photométrie de flamme

(FPD) 8

II.3.7 Détecteur thermoionique (NPD) 8

II.3.8 Détecteur à photoionisation _ 8

II.4 Classification des phases

stationnaire _ 8

II.4.1 Indice de Kovats et droite de

Kovats 8

II.4.2 Constantes de phases stationnaires 9

II.5 Optimisation de séparation _ 9

chapitre III Chromatographie en phase liquide 10

III.1 Comparaison chromatographie phase

liquide et phase gaz 10

III.2 Loi de Darcy 10

III.3 Solvants utilisés en HPLC _ 10

III.3.1 Interactions moléculaires entre

phase mobile et solutés 11

III.3.2 Force éluante et polarité 11

III.3.3 Polarité selon Snyder 11

III.4 Appareillage _ 12

III.4.1 Dispersion hors colonne 12

III.4.2 Réservoirs de solvants 12

III.4.3 Dispositif de pompage 13

III.4.4 Dispositif d’injection _ 13

III.4.5 Colonnes 13

III.5 Détecteurs 13

III.5.1 Photomètre UV-visible 13

III.5.2 Réfractomètre 14

III.5.3 Détecteur fluorimétrique 14

III.5.4 Détecteur électrochimique 14

III.5.5 Conductimètre 14

III.5.6 Diffusion de lumière 14

chapitre IV Chromatographie de partage 15

IV.1 Introduction _ 15

IV.2 Phases normales 15

IV.3 Phases inversées 15

chapitre V Chromatographie d’adsorption _ 16

V.1 Phase stationnaire _ 16

V.2 Phase mobile _ 16

V.3 Mécanisme de rétention _ 16

V.3.1 En CCM _ 16

V.3.2 Théorie de Snyder 16

chapitre VI Chromatographie ionique 17

VI.1 Introduction _ 17

VI.2 Chromatographie d’échange d’ions 17

VI.3 Appariement d’ions 17

VI.3.1 Influence de divers paramètres 17

chapitre VII Electrophorèse capillaire 18

VII.1 Introduction _ 18

VII.2 Définitions 18

VII.2.1 Propriétés des électrolytes 18

VII.2.2 Mobilité électrophoretique µ ep 18

VII.2.3 Mobilité électroosmotique µ eo 18

VII.2.4 Mobilité apparente 18

VII.3 Analyse quantitative _ 19

VII.3.1 Injection _ 19

VII.3.2 Détection _ 19

I - Notions

fondamentales

I.1 Paramètres fondamentaux :

• Coefficient de distribution K A : 

Temps de rétention t R , volume de rétention V R

Temps de rétention t R ’, volume de rétention réduit V R ’

t R =t R ’+t 0

t 0 : temps mis par la phase mobile pour aller de l’injecteur au détecteur.

• Facteur de capacité k’ : 

Rqe : k’ ne dépend que de la nature des phases.

• Sélectivité α : 

Les pics sont séparés si α>1,1.

Rqe : α ne dépend que de la nature des phases stationnaire et mobile.

• Résolution Rs : 

Les pics sont résolus si Rs>1,5.

Rqe : Rs dépend des conditions opératoires.

Si ω 1 = ω 2 ,

; En effet si ω 1 = ω 2 alors ω 1 +ω 2 = 2ω 2 d’où

,

or t R1 = t 0 (k’ 1 +1) et t R2 = t 0 (k’ 2 +1) d’où

, or

ainsi

de plus

soit

I.2 Efficacité des colonnes :

• Nombre de plateaux N : 

H : hauteur équivalente à un plateau théorique, 100<N<500000.

Rq : Si on augmente la longueur de la colonne, k’ n’est pas modifiée ; le nombre de plateaux ne dépend pas de la nature des phases.

• Nombre de plateaux théoriques : 

N traduit la finesse des pics, il a un effet sur Rs mais pas sur α.

• Dispersion :

Elle est due :

• à

la diffusion turbulente (anisotropie d’écoulement), mouvement du soluté entraînée par la phase mobile sans interaction avec la phase stationnaire. A

• à

la diffusion longitudinale assimilée au mouvement brownien, mouvement du soluté avec la phase mobile immobile sans interaction avec la phase stationnaire. B/u (dépend de la vitesse de la phase mobile)

• à

la résistance au transfert de masse. C.u

Théorie de Van Deemter :

H=A+B/u+C.u, approximation car A et C ne sont pas complètement indépendants.

Théorie de Knox :

H=A.u 1/3 +B/u+C’.u

I.3 Analyse quantitative

• Etalonnage externe :

Préparation de solutions de titres connus. Tracé de Signal=f(C)

• Etalonnage interne :

1 . Préparation de solutions étalons A 1 de titre x 1 , A 2 de titre x 2 , A 3 de titre x 3 . 2 . Préparation d’une solution d’étalonnage interne (EI). 3 . Mélange d’un volume constant de A et d’un volume constant d’EI.

V 1 =V A1 +V EI

V 2 =V A2 +V EI

V 3 =V A3 +V EI

Tracé de A A /A EI =f(C A )

Choix de l’étalon interne :

• Inerte

chimiquement vis-à-vis du soluté

• Être

séparé des autres analytes

• Comportement

physico-chimique proche du soluté

• Concentration

de l’étalon interne du même ordre de grandeur que l’analyte

• Méthode des ajouts dosés :

On s’affranchit du volume injecté et de l’ajout d’un composé non présent.

On introduit l’échantillon contenant A et B, et on ajoute des quantités connues m A de A dans l’échantillon.

V 1 =V AB +V A

V 2 =V AB +2*V A

V 3 =V AB +3*V A

Tracé de A A /A B =f(m A )

II - CPG

I.4 Cinétique de séparation

Interactions :

Soluté Û Phase Stationnaire

Gaz vecteur : H 2 , He, N 2 , Ar, CO 2 ; le choix du gaz est conditionné par le détecteur.

I.5 Appareillage

• L’injecteur amène en tête de colonne l’échantillon

sous forme gazeuse avec une dispersion faible, on peut injecter des liquides, des gaz et dans certains cas des solides.

• Mode d’injection :

• Par

vaporisation directe

• Split/Splitless :

en mode split, permet de limiter les quantités d’échantillon injecté dans la colonne pour les colonnes capillaires. On définit un rapport de Split comme la fraction d’échantillon injecté.

• On-column

à froid : l’échantillon est déposé à faible température et entraîné après vaporisation rapide en tête de colonne.

• Autre

type : vaporisation programmé, vanne d’injection, headspace.

I.5.1 Les colonnes remplies

La phase stationnaire est un solide et met en jeu un équilibre d’ adsorption .

• Matériau :

acier, téflon, verre.

• Diamètre

interne du tube 1/16 à ¼.

• Longueur :

2 à 3 mètres.

• Le

tube est rempli d’un support :

o Noir de carbone, graphite (carbopack B) sépare les composés en fonction de la taille.

o Tamis moléculaire au carbone (carbox en 1000) analyse les gaz et les hydrocarbures légers (surface spécifique > 1200 m 2 .g -1 ).

o Polymères.

o Terre de diatomées (Chromsorb P).

o Silice-Alumine-Zéolithes.

• Débit :

10 à 40 mL.min -1 .

• Diamètre

des particules : 3 à 5 m m.

• Porosité :

fraction de vide dans la colonne

V 0 : volume de vide, D : diamètre du tube, L : longueur du tube.

La porosité totale est égale à la somme de la porosité intergranulaire (entre les grains) et intragranulaire (dans les grains).

I.5.2 Les colonnes capillaires

Si la phase stationnaire est un liquide immobilisé sur un solide, elle met en jeu une constante de partage gaz/phase liquide .

Si la phase stationnaire est une espèce organique liée chimiquement à une surface solide, elle met en jeu une constante de partage gaz/phase greffée .

Exemples de phases stationnaires : hydrocarbures ramifiés (squalane), polydialkylsiloxanes (silicones SE30®, OV17®, CPSIL5®) greffés ou non, polyéthers (Carbowax®) et polyesters (DEGS).

Les colonnes sont constituées d’un tube de silice fondue de diamètre externe 0,25 à 2 m m à l’intérieur duquel est déposée une phase stationnaire de diamètre interne 0,05 à 0,35 m m.

• WCOT (wall coated open tubular)

porosité = 1

• PLOT (porous layer open tubular)

porosité ≠ 1

Le volume injecté dans PLOT est plus élevé.

• Matériau :

silice fondue.

• Diamètre

interne : 0,05 à 0.35 m m.

• Longueur :

10 à 100 m.

• Support :

greffage sur la silice fondue.

• Phase

stationnaire immobilisée par réticulation, polymérisation ou greffage chimique.

• Débit :

0,1 à 5 mL.min -1 .

I.5.3 Les colonnes semi-capillaires

• Matériau :

silice fondue.

• Diamètre

interne : 0.53 m m.

• Longueur :

5 à 50 m.

• Support :

greffage sur la silice fondue.

• Phase

stationnaire immobilisée par réticulation, polymérisation ou greffage chimique.

• Débit :

1 à 15 mL.min -1 .

I.6 Détecteurs

I.6.1 Caractéristiques d’un détecteur

• Bonne

sensibilité.

• Bonne

stabilité et reproductibilité.

• Réponse

linéaire sur plusieurs décades de concentrations.

• Domaine

de température de fonctionnement compris entre la température ambiante et au moins 400°C.

• Temps

de réponse rapide et indépendant de la vitesse d’écoulement.

• Grande

fiabilité et facilité d’utilisation.

• Réponse

uniforme ou sélective pour différents solutés.

• Conservation

de l’intégrité de l’échantillon.

I.6.2 Définition

• Limite

de détection (LD) : c’est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal bruit au moins égal à 3.

• Limite

de quantification (LQ) : c’est la quantité de soluté requise pour avoir un rapport signal bruit au moins égal à 10.

• Domaine

de linéarité (LL) : domaine dans lequel la réponse du détecteur est directement proportionnelle à la concentration.

•  Sélectivité :

propriété du détecteur à ne pas répondre de la même manière à toutes les espèces x, capacité à analyser des molécules spécifiques.

• Sensibilité :

capacité d’un détecteur à répondre é de faibles variations de C ou de m.

I.6.3 Catharomètre

Détecteur à conductibilité thermique quasi universel comprenant un montage différentiel (pont de Wheastone) dont les résistances compensent le déséquilibre de conductivité par une perte de chaleur.

Le gaz vecteur doit avoir une bonne conductibilité thermique tel que H 2 ou He et posséder une conductivité différente de celle des solutés.

Caractéristiques :

• LD :

10 -9 g.mL -1

• Linéarité

faible : 3 à 4 décades (10 à 10000).

• Volume

de 20 µL à 140 µL.

• Répond

en concentration

• Contrôle

de température est très important.

I.6.4 Détecteur à ionisation de flamme (FID)

Détecteur le plus utilisé et spécifique aux composés carbonés sauf HCHO et HCOOH.

Principe :

• Les

composés sont brûlés dans une flamme air-H 2 .

• On

forme des radicaux CH°, CH 2 °, CH 3 °.

• Ionisation

CH°→CHO + +e - en présence d’O 2 .

• Amplification

du signal électrique.

Caractéristiques :

• LD :

2.10 -12 nC.g -1 .

• Linéarité :

7 décades.

• Répond

en masse.

• Bonne

sensibilité.

• Nécessite

2 bouteilles pour la flamme.

• Le

courant produit est quasi proportionnel au nombre d’atomes de carbone.

I.6.5 Détecteur à capture d’électrons

Détecteur spécifique aux dérivés halogénés. L’électron est formé à partir d’un gaz par des particules β - provenant du 63 Ni ou du tritium. N 2 →N 2 + +e -

Mécanisme : M+e - →M - // M - +N 2 + →M+N 2

On mesure la variation de courant électrique entre I° (en l’absence de molécules) et I (courant résiduel en présence de soluté). I=I°e -kC , détecteur non linéaire.

Caractéristiques :

• Très

spécifique des composés halogénés.

• LD :

5.10 -4 g.s -1 de Lindone.

• Linéarité :

10 4 .

• Répond

en masse.

I.6.6 Détecteur à photométrie de flamme (FPD)

Détecteur spécifique du phosphore et du soufre qui émet respectivement à 526 nm et 394 nm.

On utilise une flamme qui brûle les molécules et excite les atomes émettant un rayonnement.

Caractéristiques :

• L’élément

analysé dépend du choix du filtre.

• LD : 2.10 -11 g.s -1 pour S.

3.10 -13 g.s -1 pour P.

• Linéarité :

5 décades pour P

• La

racine carré de la réponse est proportionnelle à la quantité injectée.

• Répond

en masse.

I.6.7 Détecteur thermoionique (NPD)

Détecteur spécifique aux molécules azotées et phosphorées.

Caractéristiques :

• LD :

2.10 -14 g.s -1 .

• Spécificité : N/C 10 6 .

N/P >10 2 .

• Linéarité

comparable au FID : 7 décades.

• Gaz

vecteurs : Ar, Ne, He.

I.6.8 Détecteur à photoionisation

Les composés à analyser sont ionisés par un faisceau UV intense au Xe ou Ar d’énergie respective 8,3 eV et 11,7 eV ; des électrodes collectent les ions formés.

Applications :

• Les

dérivés aromatiques et les composés insaturés.

• L’industrie

pétrolière.

I.7 Classification des phases stationnaire

I.7.1 Indice de Kovats et droite de Kovats

L’objectif est de caractériser la rétention de différents solutés sur une phase stationnaire.

Pour un alcane linéaire : I = 100n , avec n : le nombre d’atomes de carbones .

La droite de Kovats est établie sur une série d’homologues et dans des conditions opératoires fixées en régime isotherme et isobare . Log t R ’ = an+b

Pour un composé X : I X = 100α, avec α le nombre fictif d’atomes de carbones de l’alcane linéaire équivalent où

Il existe des tables de I X afin d’identifier un composé inconnu.

I.7.2 Constantes de phases stationnaires

• Constante

de Rohrchneider (1959). 5 molécules étudiées sur une phase stationnaire de référence, la squalane, et une phase stationnaire à étudier.

• Constante

de Mac Reynolds. 10 molécules témoins. Polarité = Σcstes de Mac Reynolds.

I.8 Optimisation de séparation

Paramètres :

• Température de l’injecteur est déterminée à partir

de la température des solutés.

La température de la colonne suit la loi de Van’t Hoff :

On peut aussi appliquer un gradient de température à la colonne.

• Débit du gaz vecteur.

• Choix du détecteur : TCD, FID, ECD, FPD, NPD,

photoionisation.

• Nature

du gaz vecteur imposé par le détecteur, fonction de l’efficacité souhaitée, coût/sécurité.

Le débit moyen de gaz est donné par : D m =0,47 u d

Avec u, vitesse linéaire moyenne du gaz vecteur en cm.s-1 et d : le diamètre interne de la colonne.

Relation entre Dm et Rs :

• Injecteur : choisi par l’état physique du

soluté, de la quantité introduite, de la concentration en soluté.

• Phase stationnaire (nature et géométrie) en

utilisant les constantes de Mac Reynolds.

III - Chromatographie

en phase liquide

I.9 Comparaison chromatographie phase liquide et phase gaz

Interactions :

Soluté Û Phase Stationnaire

Soluté Û Phase Mobile

Avantage CL/CG

• Température

peu importante.

• Débit

constant de phase mobile dans la colonne.

• Grand

choix de phases mobile et stationnaire.

Inconvénient CL/CG

• Coefficient

de diffusion dans la phase mobile important.

• La vitesse

d’échange entre le soluté et la phase mobile liquide est plus lente qu’entre le soluté et la phase stationnaire ; le temps d’analyse est plus long.

• La

pression dans la colonne est élevée en HPLC (la viscosité est 100 fois plus faible pour un gaz).

I.10 Loi de Darcy

avec

ΔP : perte de charge dans la colonne

Ф : facteur de remplissage de la colonne

η : viscosité dynamique (Pa.s ou Cp)

η( eau ) = 0,89 Cp , η( MeOH ) = 0,54 Cp , η( ACN ) = 0,34 Cp

u : vitesse linéaire moyenne de la phase mobile

dp : diamètre des particules de la phase stationnaire

En HPLC la pression normale est 200 bars ; on peut jouer sur la vitesse u et la viscosité du fluide afin de ne pas dégrader la colonne avec des pressions trop élevées.

I.11 Solvants utilisés en HPLC

Proportions : Tous les solvants existants > solvants chimiquement compatibles avec l’HPLC > solvants faisant des interactions avec les solutés > solvants qui vont permettre une bonne séparation.

Différents paramètres sont à prendre en compte :

• La pureté du solvant

• La volatilité, T éb faible généralement,

entraîne un risque de formation de bulles et une modification de la composition de la phase mobile par évaporation de l’un des solvants.

• La viscosité

• La compatibilité avec le soluté et l’appareillage

• La miscibilité des solvants entre eux

• La toxicité

I.11.1 Interactions moléculaires entre phase mobile et solutés

• Interactions diélectriques

• Liaisons H

• Forces de VdW

I.11.2 Force éluante et polarité

Pour les composés polaires : + la phase mobile sera polaire, + elle va entraîner les solutés.

+ la phase mobile sera apolaire, - elle va entraîner les solutés.

Pour les composés peu polaires : + la phase mobile sera polaire, - elle va entraîner les solutés et inversement

I.11.3 Polarité selon Snyder

On mesure le coefficient de distribution entre le solvant étudié et différentes phases stationnaires

Ex : éthanol : donneur de protons, dioxane : accepteur de protons, nitrométhane : moment dipolaire élevé.

La polarité globale d’un mélange de trois solvants sera : P’ = logK 1 +logK 2 +logK 3

En normant : x 1 +x 2 +x 3 = 1

Alors x 1 = logK 1 /P’

Paramètres de solubilités d’Hidelbrand

avec Es : l’énergie moléculaire de cohésion et Vs : le volume molaire de solvant

Paramètres de solubilités partielles :

δ d : interactions de dispersion du nuage électronique, interactions diélectriques

δ o : interactions d’orientation, dipôles permanents

δ i : interactions dipôles induits

δ a , δ b : interactions acide/base, par transfert de liaisons H

δ tot 2 = δ d 2 +δ o 2 +2δ o δ i +δ a δ b

Phase mobile/soluté | Non polaire/non polaire | Polaire/non polaire | Polaire/polaire

Dispersion | + | + | +

Orientation | - | - | +

Induction | - | - | +

Acide/base | - | - | +

I.12 Appareillage

I.12.1 Dispersion hors colonne

Cause un élargissement des pics autre que dans la colonne

L’efficacité observée est : l’efficacité de la colonne et la dispersion des solutés hors de la colonne (les tubes de liaisons, volume injecteur, détecteur)

La dispersion due aux tubulures :

On définit L : longueur utilisable pour ne pas augmenter la largeur des pics de 5%

avec :

Dm : diffusivité du soluté (cm 2 .g -1 )

D : débit d’éluant (mL.s -1 )

d : diamètre du tube (cm)

N : nombre de plateaux théoriques

Vr : volume de rétention (mL)

Estimation de la dispersion hors colonne : on enlève la colonne et on injecte les solutés, on obtient ainsi ω(hors colonne) = 4σ(hors colonne)

σ tot 2 = σ colonne 2 + σ hors colonne 2

I.12.2 Réservoirs de solvants

Flacons en verre, on utilise une crépine pour éliminer les poussières et les bulles.

1. filtration des solvants

2. dégazages aux ultrasons

I.12.3 Dispositif de pompage

Débits utilisés : 0,1-2 mL.min -1

Utilisation de pompes alternative : faible volume interne et utilisable avec des gradients d’élution

I.12.4 Dispositif d’injection

On dépose l’échantillon en tête de colonne.

ΔP en HPLC est de l’ordre de qqs dizaines à 100-250 bars.

Vanne d’injection :

6 voies pour les solvants

2 positions load et inject

• Remplissage

de la boucle d’injection avec V fixé (5-500 µL). Présence d’un circuit avec la phase mobile et d’un circuit avec l’échantillon.

• Envoi

de l’échantillon sur la colonne avec le circuit (pompe, boucle, colonne). Le volume injecté est constant, cela permet donc de travailler en étalonnage externe pour une analyse quantitative.

I.12.5 Colonnes

Tubes en inox de longueur L = 10 à 25 cm

d tube = 4,6 mm le plus courant

dp = 3 à 10 µm

N = 40000 à 60000 plateaux/m

On utilise aussi des micros colonnes

Avec L = 3 à 7,5 cm

Dp = 3 à 5 µm

On limite ainsi la consommation de solvants.

On place souvent des pré-colonnes qui font office de filtres ; elles ont un dp supérieur et protègent la colonne des impuretés.

I.13 Détecteurs

I.13.1 Photomètre UV-visible

Il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. E opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deuterium est utilisé pour des longueurs d'ondes variant de 190-350 nm et la lampe à vapeur de mercure est utilisé à la longueur d'onde non variable de 254 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :

• le

produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient d'absorption e soit suffisamment grand

• la

phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.

Les transitions possibles sont :

• π→π* : systèmes conjugués

• σ→σ* : non visible en UV

• n→π* : carbonyles

• n→σ* : alcools

Choix de la longueur d’onde λ de mesure en fonction du soluté et de la phase mobile qui doit peu absorber à cette longueur d’onde.

Loi de Beer-Lambert : Soit un rayon lumineux traversant une solution absorbante de concentration C et de trajet optique égal à l. Si I 0 est l'intensité du rayon lumineux à l'entrée de la solution et I son intensité à la sortie, alors :

A = D.O = log (I 0 / I) = e l C

où A est l'absorbance, D.O la densité optique , Io l'intensité lumineuse incidente , I l'intensité lumineuse transmise, e le coefficient d'extinction molaire caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée en L mol -1 cm -1 , l l'épaisseur traversée en cm et C la concentration en mol.L -1 .

Plusieurs types de détecteurs :

• Détecteur

à λ fixe : vapeur de Hg (254 nm)

• Détecteur

à λ variable

• Détecteur

à barrettes de diodes (1,2 nm/photodiode), gamme de 190 à 800 nm

Sur le spectre de soluté :

• On

choisit un λ max pour chaque soluté

• On

mesure l’absorbance avec 2 λ pour 1 soluté, alors

doit être constant

• Il

permet de vérifier la spécificité

I.13.2 Réfractomètre

Il mesure la variation de l'indice de réfraction du liquide à la sortie de la colonne. Cette mesure, extrêmement précise, dépend néanmoins de la température du liquide. On compare cet indice avec celui de la phase mobile pure : il y a donc une référence d'où le terme de variation de l'indice. Ce détecteur exclut les variations de la composition de la phase mobile ; il n'est donc possible de travailler qu'en mode isocratique avec ce détecteur.

• Contrôle

de la température indispensable à 0,1 °C

• Non

utilisable en gradient d’élution

I.13.3 Détecteur fluorimétrique

Après excitation de l’échantillon dans la gamme UV, on mesure la fluorescence restituée.

Méthode très sensible, qui permet de détecter 1 seule molécule.

I.13.4 Détecteur électrochimique

Réactions d’oxydoréductions qui produisent un courant proportionnel à la concentration du soluté. Applications : drogues, polluants, produits naturels.

I.13.5 Conductimètre

I.13.6 Diffusion de lumière

Après nébulisation, évaporation, on envoie un faisceau de lumière - Détecteur universel -

Il faut des différences de diffusivité entre le soluté et la phase mobile.

IV - Chromatographie

de partage

I.14 Introduction

Interactions : Soluté Û Phase Stationnaire & Soluté Û Phase Mobile

La phase stationnaire est soit un liquide immobilisé sur un support par adsorption, soit greffée par liaisons chimiques qui augmente la durée de vie.

Chromatographie de partage à polarité de phases normales : Phase stationnaire polaire , Phase mobile peu polaire .

Chromatographie de partage à polarité de phases inversées : Phase stationnaire apolaire , Phase mobile polaire .

I.15 Phases normales

On utilise des ph. stationnaires polaires : phases greffées (aminopropyl +polaire que cyanopropyl) et des phases mobiles apolaires pour séparer des composés polaires et moyennement polaires.

Le pouvoir éluant d’une phase mobile est la somme des polarités de chacun des solvants.

I.16 Phases inversées

On utilise des phases stationnaires a polaires : phases C8 ou C18 et des phases mobiles polaires (eau) pour séparer des composés peu polaires (hydrophobes) et moyennement polaires.

La phase mobile est constituée d’un fort pourcentage d’eau.

Attention à la miscibilité de tous les solvants ex : MeOH, ACN, THF, CH 2 Cl 2 .

Coefficient de partage octanol/eau :

P oe = K ow =

Log K ow = Σf i +cste

Avec , fi les cstes de Rekker, Log k’ = a log P oe + b, k’ facteur de capacité et a et b cste dépendant de la phase mobile.

Phases isoéluantes : phases qui conduisent à des k’ voisins mais les interactions mises en jeu peuvent être différentes.

2 phases isoéluantes pour un couple de solutés ne le seront pas pour un autre couple.

loi générale : log k’ = Aφ 1 2 +B φ 2 +C

avec φ 1 composition du solvant 1 dans la phase mobile

Pour un mélange binaire : log k’ = log k’ 0 – mc

k’ 0 : facteur de capacité avec pour ph. mobile (eau)

m : force de solvant

c : % de solvant

Pour un mélange ternaire (eau, solv1, solv2) :

A 1 φ 1 2 +A 2 φ 2 +B 1 A φ 1 2 +B 1 φ 1 +B 2 φ 2 +C+D φ 1 φ 2

Pour une famille d’homologues : log k’ = An+B

V - Chromatographie

d’adsorption

I.17 Phase stationnaire

Silice : adsorbant très polaire

La capacité d’adsorption et la polarité varient en fonction du taux d’hydratation.

I.18 Phase mobile

Mélange de solvant

Avec ε 0 force éluante

Si ε 0 = 0, pas d’adsorption de phase mobile sur phase stationnaire

Si ε 0 augmente alors le pouvoir éluant augmente aussi et les molécules de phase mobile prennent la place des molécules de soluté.

I.19 Mécanisme de rétention

I.19.1 En CCM

La phase stationnaire est immobilisée et la migration se fait par capillarité.

La vitesse de migration du solvant est

et celle du soluté

où t M est le temps de migration.

D’où

Sur la colonne

et

d’où

Les vitesses étant égales en CCM et en HPLC :

I.19.2 Théorie de Snyder

Loi de rétention :

Loi de Snyder :

β* étant le taux d’activité de la silice : si = 1 silice déshydratée, si = 0 silice désactivée.

Le domaine d’application se situe dans la séparation d’isomères.

VI - Chromatographie

ionique

I.20 Introduction

Elle sépare les solutés ioniques (sels) ou ionisables (molécules organiques) et tend à être remplacée par l’électrophorèse capillaire.

3 types :

• Échange

d’ions

• Appariement

d’ions

• Exclusions

d’ions

I.21 Chromatographie d’échange d’ions

La phase stationnaire est ionique :

• Soit

cationique/anionique forte (ne varie pas en fonction du pH)

• Soit

cationique/anionique faible (varie en fonction du pH)

Une phase stationnaire anionique permet de séparer des cations

La phase mobile est un électrolyte, la rétention dépend du pH, de la force ionique

Si I augmente, k’ diminue, il y a rétention de la phase mobile sur la phase stationnaire.

Détection : Conductimétrie : on mesure la conductance de la solution et on place des suppresseurs d’ions pour augmenter la sensibilité.

I.22 Appariement d’ions

On ajoute dans la phase mobile un agent d‘appariement d’ions (AAI) = un tensioactif.

La phase stationnaire est similaire à la chromatographie de partage en phase inversée.

I.22.1 Influence de divers paramètres

• Longueur

de la chaîne C n de l’AAI : log(k’-k’ A ) = n a

• Concentration

de l’AAI : k’ = [AAI] a

• Ajout

d’un solvant organique, si sa concentration augmente, la rétention diminue ; on l’utilise pour solubiliser les espèces.

VII - Electrophorèse

capillaire

I.23 Introduction

Méthode qui permet la séparation d’espèces en milieu biologique (protéines) difficilement séparée par l’HPLC.

L’électrophorèse de zone : migration des espèces chargées dans un champ électrique, et en solution dans l’électrolyte.

I.24 Définitions

I.24.1 Propriétés des électrolytes

Ions, molécules ou particules chargées soumises à un champ électrique subissent une force :

Force de friction :

D’où la vitesse de la particule

I.24.2 Mobilité électrophoretique µ ep

Mobilité de l’espèce chargée dans un électrolyte supposé immobile :

• Si

l’espèce est positive µ ep >0

• Si

l’espèce est négative µ ep <0

Et

I.24.3 Mobilité électroosmotique µ eo

Mobilité de l’électrolyte

Une espèce neutre se déplace à la vitesse

I.24.4 Mobilité apparente

Soit la tension appliquée V dans un champ E, avec L, la longueur du capillaire :

Soit le temps de migration, avec l, la longueur de migration :

Alors

I.25 Analyse quantitative

I.25.1 Injection

Soit q i la quantité de produit détectée ; alors quelque soit le mode de détection :

, avec A i la concentration de produit i dans l’électrolyte et t Mi son temps de migration.

En injection hydrodynamique : la composition de l’échantillon n’est pas modifiée.

Alors

En injection électrocinétique : l’injection se fait via un champ électrique donc les compositions de l’échantillon injecté et de l’échantillon dans l’électrolyte sont différentes.

Alors

I.25.2 Détection

En E.C. les solutés traversent la cellule de détection à leur vitesse propre, ce qui fait qu’on détecte une quantité q de produit dans un volume V de concentration C pendant dt.

Avec un détecteur linéaire la réponse est proportionnelle à la concentration.

Quantité de produit détecté q :

S : section du capillaire

v : vitesse du produit dans le capillaire

V : volume de produit de concentration C

K : cte